Le cannabidiol inhibe les réponses neuro-inflammatoires et le circuit

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7907 (2023) Citer cet article

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Le cannabidiol (CBD), phytocannabinoïde non euphorisant, a été utilisé avec succès pour traiter les épilepsies de l'enfance. Ces conditions sont associées à des retards de développement qui incluent souvent l'apprentissage vocal. Le chant du diamant mandarin, comme le langage, est un comportement complexe appris au cours d'une période sensible de développement. La qualité de la chanson est maintenue grâce à un raffinement sensorimoteur continu impliquant des circuits qui contrôlent l'apprentissage et la production. Au sein du circuit moteur vocal, HVC est une région de type cortical qui, lorsqu'elle est partiellement lésée, perturbe temporairement la structure du chant. Nous avons précédemment découvert que le CBD (10 mg/kg/jour) améliore la récupération vocale post-lésionnelle. Les présentes études ont été réalisées pour commencer à comprendre les mécanismes éventuellement responsables de la protection vocale du CBD. Nous avons constaté que le CBD réduisait considérablement l'expression des médiateurs inflammatoires et des marqueurs de stress oxydatif. Ces effets ont été associés à une expression régionalement réduite du marqueur microglial TMEM119. Comme la microglie est un régulateur clé de la réorganisation synaptique, nous avons mesuré les densités de synapse, trouvant des diminutions significatives à l'échelle du circuit induites par les lésions qui ont été largement inversées par le CBD. La protection synaptique s'accompagnait de l'activation de NRF2 et de l'expression de BDNF/ARC/ARG3.1/MSK1 impliquant des mécanismes importants pour l'atténuation du stress oxydatif et la promotion de l'homéostasie synaptique. Nos résultats démontrent que le CBD favorise un éventail de processus neuroprotecteurs compatibles avec la modulation de plusieurs systèmes de signalisation cellulaire, et suggèrent que ces mécanismes sont importants pour la récupération post-lésionnelle d'un comportement appris complexe.

Le cannabis et bon nombre des molécules bioactives qu'il produit sont étudiés depuis des décennies1. Ces efforts ont abouti à l'identification de centaines de phytocannabinoïdes, dont deux se distinguent comme thérapeutiques : le cannabidiol (CBD) et le Δ9-tétrahydrocannabinol (THC). Jusqu'à récemment, l'intérêt pour le CBD avait été éclipsé par une concentration sur le THC, plus efficace et euphorisant. Le CBD à action plus subtile fait désormais l'objet d'une attention thérapeutique accrue, car une formulation d'origine botanique a été approuvée pour la commercialisation aux États-Unis pour traiter les troubles épileptiques chez l'enfant2.

Ces troubles convulsifs sont associés à un retard de développement du langage3. Les enquêtes auprès des soignants des essais sur l'épilepsie infantile suggèrent que le CBD améliore la communication vocale4,5. Pour étudier l'utilité potentielle du CBD dans les troubles de la parole et du langage, nous avons utilisé un oiseau chanteur à apprentissage vocal, le diamant mandarin, comme modèle animal préclinique.

Comme le langage humain, le chant s'apprend au cours d'une période sensible du développement6. Tout comme les humains, l'apprentissage vocal des oiseaux chanteurs dépend de l'établissement de circuits reliant les régions cérébrales corticales, striatales et thalamiques7. Les profils d'expression génique démontrent des similitudes distinctes entre l'apprentissage vocal des oiseaux chanteurs et humains8,9 et les régions motrices10. Par exemple, les preuves étayent les similitudes fonctionnelles entre les couches 2, 3 et 6 du cortex moteur laryngé humain (LMC) et le HVC (nom propre) de l'oiseau chanteur, que chacun pilote la sortie du moteur vocal (de la couche 5 du LMC et du noyau robuste de l'arcopallium [RA] de l'oiseau chanteur). , respectivement9).

Auparavant, en utilisant une méthode de microlésions HVC bilatérales pour perturber la qualité des vocalisations11, nous avons constaté que les traitements quotidiens avec 10 mg/kg de CBD diminuaient l'ampleur de la perturbation du chant et amélioraient le temps de récupération12. Pour la présente étude, afin de réduire l'impact sur les animaux et de permettre des contrôles intra-sujet statistiquement puissants, nous avons adopté une approche de lésion unilatérale. Les premiers résultats ont indiqué que, comme la méthode bilatérale, les microlésions unilatérales de HVC perturbent de manière réversible les schémas de chant, mais avec une ampleur d'effet plus modeste. De plus, nous avons constaté que les microlésions de l'hémisphère gauche produisaient une perturbation vocale plus importante que les microlésions de l'hémisphère droit, ce qui correspond à la latéralisation vocale des oiseaux chanteurs rapportée par d'autres13. Notez que parce que la récupération dépend de la perception auditive (les oiseaux devenus sourds ne s'améliorent pas14), un réapprentissage sensorimoteur adulte est nécessaire. Notre objectif actuel est d'améliorer la compréhension des mécanismes par lesquels le CBD protège la qualité vocale et améliore la récupération dépendante de l'apprentissage d'un comportement moteur complexe.

De nombreuses preuves montrent que le CBD a une activité de stress anti-inflammatoire et anti-oxydante impliquant l'activation et la migration des cellules immunitaires vers les zones de lésion du SNC15. Par exemple, une étude d'expression génique utilisant le profilage génique basé sur des puces à ADN indique que le CBD atténue plusieurs événements cellulaires en modulant l'expression de facteurs de transcription pro-inflammatoires, de cytokines et de récepteurs de cytokines (qui sont notamment libérés par la microglie et contrôlés par le maître régulateur antioxydant , NRF216,17). Des expériences RNASeq plus récentes démontrent une expression altérée par le CBD des médiateurs immunitaires dans le cortex préfrontal et une amélioration cognitive probablement associée dans un modèle de schizophrénie chez le rat18. Dans un modèle de souris Alzheimer, le CBD stimule les anti-inflammatoires hippocampiques et favorise l'expression des gènes de l'autophagie homéostatique19. Compte tenu de ces exemples d'activité anti-inflammatoire du CBD, nous avons suspecté l'implication de mécanismes similaires dans la récupération vocale. Pour commencer à tester cette possibilité, nous avons étudié la modulation par le CBD de l'expression post-microlésionnelle des cytokines inflammatoires, des marqueurs du stress oxydatif neuronal, de l'infiltration de microglie/macrophage et des modifications associées des densités synaptiques dans les régions de contrôle des chansons pertinentes (Fig. 1).

Résumé des régions d'intérêt du cerveau de la chanson. (A) Représentation schématique des régions cérébrales ciblées et de leurs interconnexions. Les microlésions ciblent le VHC et produisent des déficits vocaux dont la récupération dépend de l'apprentissage sensorimoteur (les oiseaux devenus sourds ne récupèrent pas14). Les flèches rouges représentent la voie antérieure du cerveau antérieur (AFP), un circuit cortico-basal ganglia-thalamique essentiel pour l'apprentissage vocal et induisant la variabilité vocale à l'âge adulte. Les flèches vertes représentent les voies motrices vocales. Les régions en pointillés indiquent les emplacements approximatifs x, y des régions non visibles dans le panneau B. (B) Est une image représentative en fond noir utilisée pour identifier les sections avec les régions d'intérêt et pour définir leurs frontières pour les superposer aux images obtenues ultérieurement par microscopie confocale. Cette image a été utilisée pour produire le traçage de type caméra lucida dans le panneau A. Notez que l'organisation nucléaire distincte des régions de chant contraste avec le cortex de mammifère stratifié et permet de cibler les lésions, la dissection et d'autres manipulations. Rostral est approximativement droit, dorsal vers le haut, et barres = 1 mm. Abréviations : HVC (nom propre), lMAN (noyau magnocellulaire latéral du nidopallium antérieur), RA (noyau robuste de l'arcopallium), Area X (Zone X du striatum, notez que le striatum des oiseaux chanteurs contient également des neurones et des interneurones à projection pallidale qui distinguent anatomiquement du striatum de mammifère qui sépare ces caractéristiques20).

Dans d'autres systèmes, le CBD présente une efficacité anti-inflammatoire et antioxydante qui est en partie responsable de son activité neuroprotectrice21,22. Pour évaluer si la récupération vocale améliorée par le CBD peut impliquer une efficacité anti-inflammatoire similaire, nous avons quantifié l'expression de plusieurs médiateurs pro- et anti-inflammatoires (Fig. 2A – D). En utilisant la technique de dissection par micro-punch (décrite ci-dessous), 24 h après les microlésions, nous avons isolé les tissus pour l'extraction d'ARN, la synthèse et l'amplification de l'ADNc à partir des régions de chant dans les nœuds du moteur (HVC et RA) et l'apprentissage des circuits essentiels (Zone X, notez la dissection par micro-punch L'approche utilisée est illustrée dans la Fig. S2 supplémentaire). Modèles mixtes L'ANOVA a révélé que les traitements au CBD réduisaient significativement l'expression du facteur (par rapport aux témoins de véhicule) des médiateurs pro-inflammatoires IL-6 (au sein du HVC en moyenne = 0,615 [0,243–0,987], p = 0,0002 ; IL-1Β (au sein du HVC en moyenne = 1,33 [0,427–2,222], p = 0,0015 ; et RA en moyenne = 1,44 [0,542–2,337], p = 0,0005 ; RA en moyenne = 0,563 [0,192–0,935], p = 0,0008 ; et Zone X en moyenne = 0,435 [0,063–0,807], p = 0,0141, voir Fig. 2A–C) La zone lésée, HVC et RA ont montré une réduction supplémentaire de l'expression du TNFα (HVC en moyenne 0,275 [0,087–0,462], p = 0,0016, RA en moyenne = 0,292 [0,105–0,48], p = 0,0008), qui n'était pas statistiquement significatif dans la zone X (en moyenne = 0,035 [− 0,222–0,153], p = 0,960). En plus de diminuer l'expression des médiateurs pro-inflammatoires, le CBD a Il a également été démontré qu'il régule à la hausse la cytokine anti-inflammatoire IL-1023. Nous avons quantifié les différences d'expression de l'IL-10 et constaté qu'elles étaient significativement augmentées dans le CHV des oiseaux traités au CBD (en moyenne = 0,512 [0,152–0,872, p = 0,0023) et RA (en moyenne = 0,487 [0,127–0,846], p = 0,004) mais pas dans la zone X (en moyenne = 0,008 [− 0,368–0,352], p > 0,99, voir Fig. 2D).

Le CBD favorise un schéma d'expression des gènes anti-inflammatoires et anti-oxydants liés au stress. Les régions cérébrales des circuits vocaux-moteurs (HVC et RA) et des circuits d'apprentissage (Zone X) ont été disséquées par micropunch, l'ARN total extrait, l'ADNc synthétisé et amplifié par PCR. L'expression génique de l'IL-1B, de l'IL-6, de l'IL-10, du TNFα et de la SOD2 a été normalisée par rapport au contrôle endogène (GAPDH) et le changement de pli par rapport à l'hémisphère non lésé a été exprimé en 2−∆∆CT. Pour quantifier, l'ADNc de n = 5 par groupe a été amplifié en triple et la valeur moyenne du seuil de cycle (Ct) a été calculée. La valeur moyenne de Ct a ensuite été utilisée pour une analyse plus approfondie. (A) Le CBD a diminué de manière significative l'expression moyenne de l'IL-6 pro-inflammatoire dans le VHC, la PR et la zone X. (B) Le CBD a diminué l'expression moyenne de l'IL-1Β dans le VHC et la PR mais pas dans la zone X. (C) TNFα a été diminuée dans le HVC et la PR mais pas dans la zone X. (D) l'expression moyenne du médiateur anti-inflammatoire IL-10 a été augmentée dans le HVC et la PR mais pas de manière significative dans la zone X. (E) Expression du marqueur du stress oxydatif, la superoxyde dismutase 2 (SOD2) a diminué au sein du HVC et de la PR. Notez que le tissu a été obtenu 24 h après la lésion et représente donc un «instantané» de l'expression des cytokines inflammatoires dont on sait qu'il varie avec le temps après la blessure24. Les différences entre les groupes ont été évaluées par des modèles mixtes ANOVA avec la correction de comparaison multiple de Sidak.

Conformément à son efficacité anti-inflammatoire, il a été démontré que le CBD affecte l'équilibre redox par une activité antioxydante directe et indirecte25. L'expression de la superoxyde dismutase 2 (SOD2), un gène qui code pour la protéine mitochondriale SOD2 responsable de la liaison des sous-produits du superoxyde, a montré une diminution significative liée au CBD au sein du HVC (par pli moyen = 0,8768 [0,269–1,49], p = 0,002), et RA (pli moyen = 0,701 [0,093–1,31], p = 0,018), mais pas dans la zone X (pli moyen = 0,4841 [− 0,124–1,092], p = 0,162, voir Fig. 2E).

Pour confirmer que la diminution de l'expression de SOD2 s'accompagnait d'une diminution générale du stress oxydatif, nous avons utilisé l'indicateur de superoxyde dihydroéthidium (DHE, voir Fig. 3). Lorsqu'il est oxydé, le DHE intercale les noyaux de marquage d'ADN génomique double brin avec une fluorescence rouge. Dans le groupe véhicule, nous avons constaté que les microlésions augmentaient significativement la fluorescence cellulaire totale corrigée (CTCF) de la coloration DHE dans le HVC (en moyenne = 52 215 [26 635–77 796], p < 0,0001), RA (de 49 460 [23 880–75 041], p < 0,0001 ), et Zone X (par 29 817 [4237–55 397], p = 0,0152 voir Fig. 3A). En revanche, il n'y avait aucune différence significative dans la coloration au DHE entre les hémisphères non lésés des animaux traités avec le véhicule et ceux traités au CBD (Fig. 3B VEH non lésé vs CBD non lésé 3a, b, e, f, I, j). (HVC, en moyenne = 1777 [23 803–27 358], p > 0,9999 ; RA, en moyenne = 2194 [− 27 775–23386], p > 0,9999 ; et Zone X, en moyenne = 4280 [− 21 300–29 861], p = 0,9980). En comparant la coloration au DHE dans les hémisphères lésés des animaux traités avec le véhicule et le CBD, le CBD a réduit les intensités dans le HVC (en moyenne = 33 153 [7573–58 734], p = 0,0056), RA (en moyenne = 30 998 [5417–56 578], p = 0,0107), et Zone X (en moyenne = 28 089 [2 508–53 669], p = 0,0250 voir Fig. 3B). De plus, en comparant les groupes de traitement à leurs témoins non lésés respectifs, les traitements au CBD ont significativement réduit les changements liés aux lésions dans l'expression de la DHE dans toutes les régions (HVC en moyenne = 181,5 % [53,91–309,1], p = 0,0045 ; RA en moyenne = 143,6 % [16,04 –271,2], p = 0,0248 et Zone X en moyenne = 152,0 % [24,40–279,6], p = 0,0171 voir Fig. 3C).

Le CBD a diminué les espèces réactives de l'oxygène dans les hémisphères lésés, comme l'indique l'intensité de la coloration au dihydroéthidium (DHE, en rouge). (A) Images confocales représentatives affichant une coloration DHE régionale indicative des espèces réactives de l'oxygène (ROS) en fonction de l'état de la lésion et du traitement. (B) Résumé de la fluorescence cellulaire totale corrigée moyenne (CTCF) de la coloration DHE dans chaque zone en utilisant une zone circulaire d'un diamètre de 0,5 mm (voir les méthodes pour les détails de calcul du CTCF). Dans le groupe véhicule, les microlésions ont augmenté de manière significative la fluorescence totale de la coloration DHE dans HVC, RA et Area X. Une augmentation significative de la coloration DHE induite par la lésion n'a pas été observée dans les groupes traités au CBD. Dans toutes les régions cérébrales des hémisphères lésés, la coloration au DHE était significativement plus faible dans les groupes traités au CBD par rapport aux témoins. (C) En comparant les mesures de contrôle transformées en % de la coloration au DHE dans les hémisphères lésés des animaux traités avec le véhicule et le CBD, le CBD a réduit les intensités dans le HVC, le RA et la zone X. Le traitement au CBD a considérablement réduit les changements liés aux lésions dans l'expression du DHE dans toutes les régions en tant que pourcentage de leur hémisphère de contrôle respectif. Les valeurs de gris moyennes ont été déterminées et corrigées pour la fluorescence de fond en utilisant l'intensité moyenne à l'extérieur de chaque région de chanson étudiée. Des comparaisons ont été effectuées et la signification a été déterminée à l'aide de la correction de Sidak pour les comparaisons multiples à la suite d'une ANOVA à modèles mixtes (n = 4 par groupe).

Pour confirmer que les modèles d'expression génique anti-inflammatoires et anti-oxydants induits par le CBD entraînent des changements au niveau des protéines fonctionnelles, nous avons utilisé des approches d'immunofluorescence. Nous avons mesuré l'immunofluorescence relative à l'aide d'anticorps ciblant IL-6, IL-1B et IL-10 et exprimé les résultats en pourcentage d'hémisphères non lésés (Fig. 4A – F, notez que la sélectivité des anticorps utilisés est étayée par la coloration de bandes prédominantes uniques de taille : voir Fig. S6 supplémentaire). Le CBD a significativement réduit l'expression de la protéine IL-6 liée à la lésion dans le HVC (en pourcentage moyen = 128,9 % [62,32–195,4], p = 0,0001) et la PR (de 89,37 % [22,84–155,9], p = 0,0063 Fig. 4A, B). Pour l'IL-1Β, le traitement au CBD a significativement diminué l'expression dans le VHC (en moyenne = 131,2 % [53,55–208,8], p = 0,0007) et la PR (en moyenne = 115,0 % [37,36–192,6], p = 0,0026, Fig. 4C ,D). L'expression de l'IL-6, mais pas de l'IL-1B, était régulée de manière différentielle dans la zone X (IL-6 de 72,21 % [5,679–138,7], p = 0,031 ; et IL-1B de 1,44 % [− 76,17–79,04], p > 0,9999, Fig. 4B, D). Le CBD a significativement augmenté l'IL-10 anti-inflammatoire dans la PR (en moyenne = 54,9 % [9,388–100,4], p = 0,0147) et la zone X (en moyenne = 66,5 % [20,96–111,9], p = 0,0030) alors qu'il n'y avait pas différence statistique au niveau du site lésé (HVC en moyenne = 21,4 % [− 66,85–24,14], p = 0,5612 Fig. 4E,F).

Le CBD modifie les densités de cytokines liées à l'inflammation. Des traitements quotidiens à 10 mg/kg ont été associés à une modulation de l'expression des protéines IL-1Β, IL-6 et IL-10 24 h après les lésions unilatérales du VHC. Les images confocales immunofluorescentes représentatives de la coloration des anticorps ciblant IL-1Β, IL-6 et IL-10 dans les régions motrices (HVC et RA) et essentielles à l'apprentissage (Zone X) sont présentées. (Aa-Al), images de l'hémisphère lésé montrant une distribution régionale représentative de l'IL-6 chez les oiseaux traités au véhicule par rapport aux oiseaux traités au CBD. (Ca – Cl), images démontrant la distribution régionale de l'IL-1Β. (Ea-El), images confocales démontrant la distribution régionale de l'IL-10. Des images représentatives de l'hémisphère non lésé sont présentées dans la Fig. S3 supplémentaire. B, fluorescence de l'IL-6 en pourcentage de changement par rapport à l'hémisphère témoin non lésé par région de chant et traitement médicamenteux. Le CBD a significativement réduit l'expression de l'IL-6 dans le HVC, l'AR et la zone X. D, la fluorescence de l'IL-1B en pourcentage de changement par rapport à l'hémisphère témoin non lésé par région de chant et traitement médicamenteux. Le CBD a significativement diminué l'intensité de l'IL-1Β dans le HVC et la PR. F, fluorescence de l'IL-10 anti-inflammatoire en pourcentage de changement par rapport à l'hémisphère témoin non lésé par région de chant et traitement médicamenteux. Le CBD a augmenté de manière significative l'intensité de l'IL-10 dans la PR et la zone X. Les différences ont été déterminées par une ANOVA à modèles mixtes suivie de comparaisons post-hoc corrigées par Sidak. Le logiciel Image J a été utilisé pour analyser les images z-stack projetées à l'intensité maximale et le seuil a été appliqué de manière cohérente sur toutes les images pour n = 5 par groupe.

L'activité anti-inflammatoire et anti-oxydante du CBD suggère l'implication de la régulation médiée par NRF2 des processus redox, mitochondriaux et inflammatoires pour maintenir l'homéostasie. Les résultats indiquent que le traitement au CBD a augmenté de manière significative les niveaux nucléaires de pNRF2 dans toutes les régions d'intérêt : dans HVC (en pourcentage moyen = 19,6 [3,7–35,4], p = 0,0259), RA (en moyenne = 11,65 [2,39–20,9], p = 0,0262 ) et Zone X (en moyenne = 7,1 [1,8–12,43], p = 0,0218, Fig. 5B).

Le CBD augmente la localisation nucléaire du facteur de transcription pNRF2 régulant la réponse antioxydante. (A), les images dans les régions de chant ont été prises à partir de tissus prélevés 24 h après les lésions unilatérales de HVC. La rangée supérieure (af) correspond à la coloration pNRF2. La rangée du bas (gl) est la coloration pNRF2 en rouge fusionnée avec celle de la coloration nucléaire Hoechst en bleu. (B), coloration nucléaire pNRF2 dans les régions d'intérêt de la chanson exprimée en pourcentage de la coloration nucléaire totale. Les résultats indiquent que le traitement au CBD a augmenté de manière significative le pNRF2 nucléaire dans le HVC, le RA et la zone X, conformément aux réponses antioxydantes. Le logiciel Image J a été utilisé pour analyser les images z-stack projetées à une intensité maximale et le seuil a été appliqué de manière cohérente sur toutes les images. Les différences entre les groupes ont été déterminées à l'aide d'une ANOVA à modèles mixtes suivie de comparaisons post-hoc corrigées par Sidak pour n = 4 par groupe.

L'activation, le recrutement et la phagocytose de la microglie sont des réponses inflammatoires primaires après une blessure, connues pour être médiées par la libération de cytokines et la production de superoxyde avec des effets en aval sur la cascade du complément26,27. Des preuves antérieures associent l'activation microgliale à une élévation transitoire des gènes pro-inflammatoires (c'est-à-dire IL-1Β et IL-6) qui ont été observées au pic de la mort neuronale lors de lésions tissulaires27. Compte tenu de nos résultats montrant une expression accrue des cytokines pro-inflammatoires 24 h après les chirurgies de microlésions, nous avons exploré la possibilité d'une implication microgliale dans le cadre du mécanisme d'action du CBD dans notre système. En utilisant TMEM119 comme marqueur de la microglie, nous avons étudié la coloration TMEM119 induite par les lésions dans les régions de chant (HVC, RA et zone X) et les effets du CBD sur cette expression (Fig. 6A). Les résultats indiquent que dans HVC, RA et Area X, les niveaux de TMEM119 étaient significativement plus faibles chez les animaux traités au CBD par rapport aux témoins (en moyenne 97,61 % [27,59–167,6], p = 0,0053 ; 103,8 % [33,77–173,8], p = 0,0031 et de 87,39 % [17,37 à 157,4], p = 0,0123, respectivement (Fig. 6B). Notez que notre intérêt actuel pour la microglie représente une première étape et n'exclut pas l'implication probable d'autres types de cellules dans les réponses inflammatoires induites par les microlésions ( ex. astrocytes réactifs)28.

Les traitements au CBD diminuent la densité du marqueur microglial TMEM119 dans les régions chantées des hémisphères lésés. (aa-af), l'immunofluorescence TMEM119 marque la microglie, dans laquelle une haute densité de fluorescence est présente dans le HVC, l'AR et la zone X traités par le véhicule. Une coloration TMEM119 inférieure est évidente dans le groupe traité au CBD. (ag-al), Fusionner les images de TMEM119 et de noyaux colorés par Hoechst. ( b ) Densité de TMEM119 exprimée en valeur de gris moyenne de TMEM119, coloration Hoechst relative en pourcentage de l'hémisphère non lésé. Dans HVC, RA et Area X, les densités de TMEM119 étaient significativement plus faibles chez les animaux traités au CBD par rapport aux témoins du véhicule. Les différences entre les groupes ont été déterminées à l'aide d'une ANOVA à modèles mixtes suivie de comparaisons post-hoc corrigées par Sidak pour n = 4 par groupe.

Une fonction microgliale critique comprend la compensation phagocytaire des débris axonaux et synaptiques après la dégénérescence neuronale29. Les preuves de la diminution de l'expression microgliale de TMEM119 liée au CBD nous ont amenés à nous demander si les traitements protégeaient également les densités synaptiques. Pour mesurer cela, nous avons comparé la colocalisation des marqueurs pré- et post-synaptiques, VGLUT2 et PSD-95 dans les groupes de traitement (Figs. 7, 8, 9, 10). Nous avons observé des diminutions significatives des densités synaptiques liées aux lésions. Dans le groupe véhicule, les microlésions unilatérales ont diminué la densité synaptique au sein du HVC (Fig. 10, Veh Unlesioned vs Veh Lesioned) en moyenne = 0,20/µm2 [0,025–0,38], p = 0,0272), RA en moyenne = 0,24/µm2 [0,11 –0,37, p = 0,0014) et Aire X en moyenne = 0,16/µm2 [0,007–0,31], p = 0,0410). Fait intéressant, dans les groupes PR des groupes CBD, il y avait une diminution significative des densités synaptiques après la lésion (CBD non lésé vs CBD lésé en moyenne = 0,16/µm2 [0,022–0,30], p = 0,0234) tandis que les changements de HVC et de la zone X étaient insignifiants. Cependant, le traitement au CBD a eu un effet profond sur la densité synaptique post-lésionnelle par rapport au véhicule dans le HVC (Veh Lesioned vs CBD Lesioned, en moyenne = 0,19/µm2 [0,002–0,38], p = 0,0476) dans la PR (en moyenne = 0,18/µm2 [0,05–0,32], p = 0,0088 et Zone X (en moyenne = 0,15/µm2 [0,04–0,26], p = 0,0122). = 0,076/µm2 [− 0,1126–0,2654], p = 0,7154 et Area X (en moyenne = 0,094/µm2 [− 0,019–0,21], p = 0,1094) mais les diminutions restent significatives dans la PR (moyenne = 0,16/µm2 [0,022– 0,30], p = 0,0234). Nous avons ensuite quantifié la différence de densité synaptique de l'hémisphère non lésé à l'hémisphère lésé en tant que nombre de points lacrymaux colocalisés en pourcentage de l'hémisphère témoin non lésé (Fig. 10B). Au sein des groupes HVC et RA, les groupes CBD avaient une augmentation significative de la densité synaptique post-lésionnelle (HVC en moyenne = 24,4 % [0,4095–48,41], p = 0,0,0464 ; RA en moyenne = 16,5 % [3,019–29,90], p = 0,0186) alors que la zone X ne différait pas significativement (en moyenne = 13,77 % [12,02–39,56], p = 0,3336). Bien que non significatif, il peut être important que le traitement au CBD ait tendance à augmenter les densités synaptiques dans les hémisphères non lésés par rapport au véhicule, suggérant la promotion de la synaptogenèse en plus de la protection des lésions (Fig. 10A).

Les traitements au CBD protègent les densités synaptiques glutamatergiques des pertes liées aux lésions au sein du HVC. ( a – t ) Images confocales représentatives de l'immunofluorescence illustrant la densité synaptique dans quatre groupes: VEH Unleisoned ( a – e ), CBD Unlesioned ( f – j ), VEH Lesioned ( k – o ) et CBD lésé ( p – t ). Les taches sont divisées en colonnes avec Hoechst, PSD95 (marqueur post-synaptique) et VGLUT2 (marqueur présynaptique) respectivement. La colonne quatre est une fusion de PSD95 et VGLUT2 et la colonne 5 montre un masque des points ponctuels colocalisés. Les masques de synapse montrent que, par rapport aux témoins VEH, les groupes CBD ont des densités de synapse glutamatergique significativement plus élevées 24 h après les lésions.

Les traitements au CBD protègent les densités synaptiques glutamatergiques des pertes liées aux lésions dans la PR. ( a – t ) Images confocales représentatives de l'immunofluorescence illustrant la densité synaptique dans quatre groupes: VEH Unleisoned ( a – e ), CBD Unlesioned ( f – j ), VEH Lesioned ( k – o ) et CBD Lesioned ( p – t ). La tache est divisée en colonnes avec Hoechst, PSD95 (marqueur post-synaptique) et VGLUT2 (marqueur présynaptique) respectivement. La colonne quatre est une fusion des deux taches et la colonne 5 montre un masque des points ponctuels colocalisés de PSD95 et VGLUT2. Les masques de synapse montrent que, par rapport aux témoins VEH, les groupes CBD ont des densités de synapse glutamatergique significativement plus élevées après les lésions de 24 h.

Les traitements au CBD protègent les densités synaptiques glutamatergiques des pertes liées aux lésions dans la zone X. AT, images confocales représentatives de l'immunofluorescence illustrant la densité synaptique dans quatre groupes : VEH non lésé (a–e), CBD non lésé (f–j), VEH lésé (k– o) et CBD Lésé (p–t). La tache est divisée en colonnes avec Hoechst, PSD95 (marqueur post-synaptique) et VGLUT2 (marqueur présynaptique) respectivement. La colonne 4 est une fusion des deux taches et la colonne 5 montre un masque des points ponctuels colocalisés de PSD95 et VGLUT2. Les masques de synapse montrent que, par rapport aux témoins VEH, les groupes CBD ont des densités de synapse glutamatergique significativement plus élevées 24 h après les lésions.

Les traitements au CBD protègent les densités synaptiques glutamatergiques des pertes liées aux lésions. ( a ) Quantification des densités synaptiques de la région du chant dans les hémisphères non lésés et lésés des oiseaux chanteurs traités au véhicule et au CBD. Dans le groupe véhicule, les microlésions unilatérales ont diminué la densité synaptique dans les trois régions examinées (HVC, RA et Area X). À l'inverse, dans le groupe CBD, il n'y avait pas d'effet lésionnel significatif dans le HVC ou la zone X. Cette protection n'était pas aussi robuste dans la PR, bien que le déficit ait diminué. Le traitement au CBD a eu un effet profond sur la densité synaptique post-lésion par rapport aux densités post-lésion des oiseaux traités avec le véhicule dans les trois régions d'intérêt. ( b ) Modification de la densité synaptique liée à la lésion exprimée en points ponctuels colocalisés transformés en pourcentage de l'hémisphère témoin non lésé. Au sein des groupes HVC et RA, les groupes CBD présentaient une augmentation significative de la densité synaptique post-lésionnelle tandis que la zone X ne différait pas de manière significative. Cela indique une protection significative des synapses dans des domaines clés de la production vocale. Pour l'analyse, chaque ensemble d'images z-stack a été post-traité et projeté à une intensité maximale. Les points ponctuels de VGLUT-2 et PSD-95 colocalisés dans chaque région ont été définis pour l'analyse des particules avec un seuil appliqué à partir de n = 5 animaux par groupe. Les densités des synapses glutamatergiques ont ensuite été quantifiées en pourcentage de variation par rapport à l'hémisphère témoin non lésé. La signification a été évaluée et des comparaisons appropriées ont été effectuées à l'aide d'une ANOVA à modèles mixtes avec la correction de Sidak pour les comparaisons multiples.

La récupération vocale du diamant mandarin nécessite un retour sensorimoteur14, ce qui nous a conduit à étudier les facteurs liant l'expérience à la neuroplasticité et à la mise à l'échelle synaptique homéostatique30. En quantifiant l'expression des gènes clés liés à la plasticité via qRT-PCR, nous avons trouvé des différences significatives entre les groupes de traitement dans l'expression du BDNF (F[3, 36] = 28,79, p < 0,0001), MSK1 (F[3, 36] = 57,63, p < 0,0001) et ARC/ARG3.1 (F[3, 36] = 46,53, p < 0,0001, Fig. 11).

Le CBD influence l'expression des régulateurs de mise à l'échelle synaptique. Axes Y = expression de l'ARNm de BDNF, ARC/ARG3.1 et MSK1 normalisée par rapport au contrôle domestique (GAPDH) et exprimée sous forme de changement de pli par rapport aux hémisphères non lésés (2−∆∆CT). Les échantillons d'ADNc synthétisés à partir de groupes de n = 4 sujets ont été amplifiés en triple et les moyennes tracées. ( a ) Dans la PR et la zone X des hémisphères lésés, le CBD a augmenté de manière significative l'expression moyenne du BDNF par rapport aux témoins VEH. ( b ) Dans HVC, RA et la zone X des hémisphères lésés, le traitement au CBD a augmenté l'expression moyenne de MSK1 par rapport à VEH. ( c ) Dans la PR et la zone X des hémisphères lésés, le CBD a supprimé l'expression de l'ARC / ARG3.1 par rapport au VEH. Les différences entre les groupes ont été évaluées par des modèles mixtes ANOVA avec la correction de comparaison multiple de Sidak.

Des comparaisons post-hoc ont révélé que chez les témoins VEH, les lésions augmentaient de manière significative l'expression du BDNF dans le HVC (de 1, 29 fois, IC à 95% = 0, 66—1, 92, p <0, 0001) mais pas la PR ou la zone X (Fig. 11A). Cela semble lié à la stimulation de l'expression du BDNF dans la région lésée, HVC, qui ne s'étendait pas à ses cibles de projection, RA et Area X. Ce n'était pas vrai chez les pinsons traités au CBD où des différences significatives entre les oiseaux du groupe non lésé et lésés étaient observé dans chaque région du cerveau (dans le VHC de 1,15, IC à 95 % = 0,52-1,78, p < 0,0001 ; dans la PR de 1,01, IC à 95 % = 0,38-1,64, p = 0,0007 ; dans la zone X de 1,02, IC à 95 % = 0,39–1,36, p = 0,0006).

Parce que les preuves suggèrent que le BDNF augmente l'expression de MSK1 dans la plasticité synaptique liée à l'expérience, nous avons étudié la régulation potentielle du CBD de l'expression de cette kinase. Bien que les lésions aient eu tendance à augmenter l'expression de MSK1 chez les témoins VEH, cela n'était significativement différent que dans la zone X (VEH non lésé vs VEH lésé de 0, 68, IC à 95% = 0, 24–1, 11, p = 0, 0010, Fig. 11B). En revanche, les oiseaux traités au CBD avaient significativement augmenté l'expression de MSK1 dans chaque région cérébrale d'intérêt (dans le HVC de 1,25, IC à 95 % = 0,81-1,66, p <0,0001 ; dans la PR de 1,08, IC à 95 % = 0,64-1,52, p < 0,0001 ; dans la zone X de 1,01, IC à 95 % = 0,38–1,64, p < 0,0001).

Dans les modèles de mise à l'échelle synaptique homéostatique, des niveaux élevés d'activité synaptique augmentent la signalisation de la voie BDNF/MSK132 favorisant l'expression d'ARC/ARG3.1. L'activité ARC/ARG3.1 favorise l'internalisation des récepteurs AMPA excitateurs, diminuant la force synaptique excitatrice. Pour tester si cette voie de signalisation ARC/ARG3.1 est affectée par le traitement au CBD dans notre système, nous avons mesuré les effets du traitement sur l'expression de l'ARC/ARG3.1. Fait intéressant, dans chaque région cérébrale d'intérêt des témoins traités par le véhicule, les lésions ont augmenté de manière significative l'expression de l'ARC/ARG3.1 (dans le HVC de 0,08, IC à 95 % = - 0,40–0,56, p = 0,970 ; dans la PR de 0,56, IC à 95 % = 0,079–1,04, p = 0,017 ; dans la zone X de 0,62, IC à 95 % = 0,14—1,11, p = 0,0068, figure 11C). En comparant les oiseaux lésés traités au véhicule et au CBD, l'expression de l'ARC/ARG3.1 était significativement plus faible dans la PR et la zone X, mais pas dans le HVC, des pinsons traités au CBD (dans la PR de 0,56, IC à 95 % = 0,08—1,04, p = 0,017 et Zone X de 0,62, IC à 95 % = 0,14–1,11, p = 0,007). Si, comme dans d'autres systèmes, ARC/ARG3.1 agit pour internaliser les récepteurs AMPA, nous nous attendrions à des densités plus élevées après les traitements au CBD. Nous investiguons présentement cette possibilité.

Ces expériences ont été réalisées pour identifier les mécanismes candidats qui pourraient contribuer à l'accélération de la récupération vocale précédemment observée par le CBD après des microlésions HVC ; et commencer à identifier les régions d'apprentissage et motrices impliquées. La valeur de l'étude de la neuroprotection du CBD chez les oiseaux chanteurs réside dans la capacité d'identifier les processus modifiés dans des nœuds discrets de circuits contrôlant l'apprentissage et la production vocale. Les voies de contrôle vocal chez les oiseaux chanteurs et les humains partagent des similitudes fonctionnelles convergentes qui augmentent la pertinence de la traduction par rapport aux espèces à apprentissage non vocal9,10. Une différence distincte entre les voies vocales aviaires et humaines est l'organisation nucléaire plutôt que stratifiée des régions de contrôle vocal palléal. Cette différence confère des avantages dans le ciblage des régions pour la manipulation et l'évaluation spatiale ; une fonctionnalité dont nous avons profité. En plus de HVC (la cible de microlésions pré-motrices de type cortical), nous nous sommes concentrés sur ses cibles de projection : RA (moteur de type cortical) et ; Zone X (une région striatale essentielle à l'apprentissage qui intègre également des neurones de projection pallidaux). Parce que la récupération du chant dépend de l'intégration sensorimotrice dépendante de la perception auditive (les oiseaux devenus sourds ne s'améliorent pas14), notre système modélise de manière unique la perte adulte et la récupération dépendante de l'apprentissage d'une habileté motrice complexe.

Les résultats démontrent que dans le modèle de microlésions HVC, le CBD a de puissants effets anti-neuro-inflammatoires compatibles avec ceux bien caractérisés dans les systèmes de mammifères16 (voir les figures 2 et 4). Ceci est important car la neuroinflammation est un facteur étiologique dans le développement d'un éventail de troubles du SNC33. Un exemple est la neuroinflammation chronique déclenchée par une lésion cérébrale post-traumatique qui augmente la probabilité de troubles de l'humeur et de démences précoces34. Compte tenu de l'administration chronique nécessaire pour traiter la neuroinflammation chronique, des effets secondaires importants et/ou une diminution de l'efficacité sont courants avec les thérapies actuelles35. Les effets anti-neuro-inflammatoires profonds que nous et d'autres avons observés en utilisant le CBD, combinés à la preuve d'un profil d'effets secondaires favorable36, suggèrent qu'il pourrait améliorer la capacité à gérer cette condition difficile.

Un problème potentiel lié à l'utilisation thérapeutique du CBD est le manque de sélectivité. Ce médicament interagit avec et modifie l'activité de multiples cibles cellulaires37,38. Un problème supplémentaire est la co-isolation d'autres molécules potentiellement bioactives. Les extraits de CBD purifiés contiennent au moins des traces d'autres cannabinoïdes, y compris le THC39 actif sur le SNC. Nous avons découvert que l'efficacité du CBD est influencée par la teneur en THC, ce qui souligne l'importance de formulations cohérentes et soigneusement contrôlées40. En identifiant les voies affectées par le traitement au CBD, il peut être possible d'identifier des médicaments plus sélectifs, réduisant ainsi les effets potentiels hors cible. Alternativement, un entourage des diverses interactions cellulaires du CBD peut être la clé de l'efficacité et nécessaire pour la neuroprotection. Le modèle de microlésion est prometteur pour identifier les mécanismes anti-neuro-inflammatoires et cribler de nouveaux médicaments potentiels.

Les effets anti-inflammatoires du CBD semblaient les plus importants dans la région microlésionnée, HVC, et dans une mesure progressivement moindre dans la PR et la zone X (par exemple, Fig. 2A – C). Cela coïncide avec la proximité de HVC, conformément à l'impact attendu sur les projections dégénératives plus courtes précédant les plus longues (notez les preuves de coloration à l'argent cuivrique pour cela dans la Fig. 7 supplémentaire). Parce que RA intègre la sortie à la fois de la voie d'apprentissage du cerveau antérieur (AFP) associée à la zone X et de la voie motrice postérieure (via HVC, voir Fig. 1), nous nous attendions à une entrée motrice perturbée avant celle du circuit d'apprentissage AFP. L'AFP a une fonction génératrice d'erreurs qui introduit une variabilité vocale critique pour l'apprentissage sensorimoteur et module l'activité à la fois dans RA42 et HVC (indirectement via les noyaux dopaminergiques du mésencéphale43). La persistance de la génération d'erreurs AFP, dans des conditions de contrôle moteur HVC réduit, est compatible avec la perturbation vocale induite par les microlésions. Cela peut expliquer pourquoi des effets de microlésions minimes sont observés chez les oiseaux déficients en AFP11.

Une autre explication potentielle des différences régionales dans la réactivité anti-inflammatoire est le moment de ces processus qui sont souvent coordonnés et séquentiels44. Parce que nous n'avons étudié qu'un seul point de temps de 24 h, nous ne savons pas si les réponses commençaient, se terminaient ou avaient atteint leur amplitude maximale.

Un deuxième mécanisme identifié comprenait l'atténuation du stress oxydatif par le CBD, comme l'indiquent les effets sur l'expression de SOD2 dans HVC et RA (Fig. 2E). Les effets du stress oxydatif ont été confirmés par la réduction de la coloration DHE activée par le superoxyde45 (Fig. 3). Comme les cytokines, l'ampleur de la production de superoxyde variait avec la proximité de la lésion, mais était significativement diminuée par le CBD dans le HVC et la PR (Fig. 3B). Notez que les mesures régionales de la fluorescence du DHE sont exprimées par rapport aux régions environnantes et démontrent donc des effets sélectifs dans le circuit de la chanson.

La combinaison de l'activité anti-inflammatoire et anti-oxydante du CBD a suggéré l'implication d'une réponse au stress organisée d'ordre supérieur. Conformément à cela, la signalisation est contrôlée par NRF2, un régulateur central établi des médiateurs redox, mitochondriaux et inflammatoires. Dans des conditions basales, NRF2 est une protéine cytoplasmique qui, lors d'un stress oxydatif, est activée par phosphorylation17. Le phospho-NRF2 activé se transloque vers le noyau où il agit comme un facteur de transcription régulant une multitude de gènes impliqués dans les réponses antioxydantes, autophagiques, mal repliées des protéines et d'autres réponses cellulaires46. Les augmentations significatives liées au CBD du phospho-NRF2 nucléaire observées dans notre système (voir Fig. 5) impliquent cette voie homéostatique dans notre modèle. Le fait que le CBD soit efficace à la fois : (1) réduit le stress oxydatif qui active généralement NRF2 et ; (2) une translocation nucléaire accrue de pNRF2, suggère que l'activité antioxydante du CBD est soit en aval de l'activation de pNRF2, soit que le CBD est capable d'activer NRF2 malgré une réduction des espèces réactives de l'oxygène (ou une combinaison des deux possibilités). Des expériences supplémentaires étudiant les effets dépendants du temps du CBD seront nécessaires pour clarifier la nature de la signalisation NRF2 dans ce système. Notez que les autres activateurs de la signalisation NRF2 sont des anti-inflammatoires cliniquement pertinents47. NRF2 est également puissamment activé par le sulforaphane, un antioxydant d'origine botanique, dont un dérivé est actuellement en cours d'évaluation dans l'hémorragie du SNC48. Ces médicaments plus sélectifs sont des candidats pour une évaluation anti-neuro-inflammatoire dans le système microlésionnel du VHC.

Le type d'expression de cytokines pro-inflammatoires que nous observons à la suite de microlésions (décrites ci-dessus) est, dans d'autres systèmes, associé à l'activation microgliale, à l'infiltration et à la phagocytose des débris cellulaires. Ces activités peuvent être d'une importance capitale pour la récupération neuronale par rapport à l'apoptose26. Cela nous a amenés à étudier l'activité potentielle liée à la microglie après des microlésions HVC et une récupération vocale améliorée par le CBD. Notez que cette enquête sur l'implication de la microglie représente une première étape initiale. Il est fort probable que d'autres types de cellules soient impliquées à la fois dans l'inflammation induite par les lésions et dans l'activité anti-inflammatoire du CBD (par exemple, les astrocytes réactifs)28. Des expériences utilisant des marqueurs supplémentaires sont actuellement prévues et se traduiront par une caractérisation plus complète des types de cellules actives et pertinentes pour notre système.

Actuellement, en utilisant TMEM119 comme marqueur de la microglie49, nous avons constaté que le CBD réduisait considérablement les densités de coloration compatibles avec une infiltration réduite des cellules myéloïdes (Fig. 6A, B). Ceci est intéressant car il suggère que l'activité des cellules myéloïdes induite par les dommages, au seul moment précoce de 24 h que nous avons étudié, est associée à des effets perturbateurs des microlésions, et non à la neuroprotection. L'aspect cellulaire arrondi des cellules colorées au TMEM119 24 h après la lésion suggère, mais ne prouve pas, que les microlésions augmentent les densités de microglie dans un état phagocytaire activé, et que les traitements au CBD les réduisent (comme le montre la Fig. 6Aa-b). À l'avenir, il sera important d'étudier une évolution temporelle plus complète des effets des lésions. Une autre mise en garde fait suite à des preuves récentes suggérant que TMEM119 peut ne pas distinguer la microglie des macrophages périphériques en migration de manière aussi fiable qu'on le pensait auparavant, et qu'il ne distingue pas les états activés des états inactifs50. Étant donné que la microglie peut adopter un continuum d'états d'activation : des sous-types pro-inflammatoires "M1-like" aux anti-inflammatoires "M2-like"51, il sera important dans les études futures de mesurer plusieurs marqueurs pour distinguer les types et l'activité des réponses des cellules myéloïdes50 ,52. Contrairement à d'autres mesures liées au CBD, les effets sur les densités de TMEM119 augmentées par les lésions n'ont pas été inversés à des niveaux de contrôle non lésés (Fig. S4 supplémentaire). Une hypothèse que nous testons actuellement est la capacité du CBD à déplacer les populations relatives d'espèces microgliales pro- à anti-inflammatoires.

Une fonction clé des sous-types microgliaux anti-inflammatoires et d'autres cellules myéloïdes28 dans la récupération des lésions du SNC comprend la préservation des densités synaptiques53. La protection/promotion potentielle de la CDB de la densité synaptique a été testée en mesurant la colocalisation de PSD95 et du marqueur glutamatergique présynaptique VGLUT2 (notez que les projections HVC vers la zone X et RA sont glutamatergiques54). Comme prévu, par rapport aux hémisphères non lésés, les microlésions HVC semblaient diminuer les densités dans la région elle-même, ainsi que dans ses cibles de projection (Figs. 7 et 10b, voir également les preuves de dégénérescence en argent cuivrique [Fig. S7 supplémentaire]). De manière moins attendue, le CBD a augmenté la colocalisation des marqueurs synaptiques dans les hémisphères non lésés par rapport aux témoins VEH, suggérant la promotion de la synaptogenèse de novo. Que l'activité synaptogène soit accompagnée d'une synaptoprotection supplémentaire reste une question ouverte (Figs. 7, 8, 9). La diminution de l'ampleur des perturbations vocales observées après les traitements au CBD suggère une protection potentielle des circuits établis lors de l'apprentissage de la chanson. Faciliter l'établissement de nouvelles synapses peut sous-tendre la promotion par le CBD de la récupération vocale dépendante de l'apprentissage sensorimoteur.

Un mécanisme par lequel le CBD peut protéger les synapses excitatrices consiste à moduler la mise à l'échelle synaptique. Ce processus homéostatique régit la sensibilité des synapses sous divers états d'excitation55. La mise à l'échelle synaptique est régulée par un réseau complexe de protéines et de voies de signalisation, notamment BDNF, MSK1 et Arc/Arg3.132,56. BDNF active MSK1 qui agit à son tour pour modifier l'expression d'Arc/Arg3.131. Arc/Arg3.1 régule directement la localisation synaptique des sous-types de récepteurs AMPA excitateurs d'une manière critique pour la protection homéostatique de la plasticité liée à l'apprentissage et la consolidation de la mémoire57. L'activité Arc/Arg3.1 augmente l'internalisation des récepteurs AMPA excitateurs, diminuant et réduisant la force synaptique excitatrice. Cette régulation peut protéger contre l'excitotoxicité mais, dans la mesure où les modèles d'expression du récepteur AMPA sont importants pour le maintien des circuits de chant établis pendant l'apprentissage vocal, l'augmentation de l'Arc/Arg3.1 peut entraîner la perturbation vocale observée chez les oiseaux traités avec le véhicule. La diminution de l'ampleur de la perturbation vocale observée chez les oiseaux traités au CBD peut être due à une mise à l'échelle synaptique réduite suite à une excitotoxicité liée à la lésion (évidente à partir de la coloration au CuAg, Fig. S7 supplémentaire).

Pris ensemble, nos résultats démontrent de puissants mécanismes anti-inflammatoires et synaptoprotecteurs de l'action du CBD suite à des dommages à une région de type cortical pré-moteur. Cette efficacité est associée à la promotion de multiples mécanismes liés à l'homéostasie dans les circuits de chant. Des études futures pourraient lier ces effets à une récupération vocale dépendante de l'apprentissage déjà démontrée.

Sauf indication contraire, tous les matériaux et réactifs ont été achetés auprès de Sigma Aldrich ou Thermo Fisher. Le CBD d'origine botanique (≥ 98 %) a été fourni par GW Research Ltd, Cambridge, Royaume-Uni. Des stocks concentrés de CBD ont été préparés à l'aide d'ETOH à 100% aspergé d'azote et stockés à -20 ° C. Les stocks ont ensuite été dilués avec le véhicule (2:1:17, ETOH : Alkamuls : PBS) pour produire des suspensions pour injections de 10 mg/kg de CBD. Les dosages d'éthanol résultants étaient de 0,33 mg/kg, inférieurs à ceux consommés volontairement par les diamants mandarins58. L'isoflurane (Pivetal, NDC 46 066-755-03) utilisé pour l'anesthésie a été fourni par le Département de médecine comparée de l'East Carolina University.

Les stocks de CBD, préparés comme décrit ci-dessus, ont été stockés dans des flacons stériles de 5 ml à bouchon septum à 4 ° C. Des stocks frais ont été préparés au moins une fois par semaine. Pour les injections, les préparations médicamenteuses ont été chargées dans une seringue à insuline stérile de 1 cc avec des aiguilles de 30 ga. Le matin des injections alors que les lumières étaient éteintes, les oiseaux ont été capturés à la main et le site d'injection du muscle pectoral a été exposé par des plumes de nattes avec un petit volume d'ETOH à 70 % délivré par un flacon gicleur. Des injections de 50 ul ont été faites dans l'un des quatre quadrants du pectoral, en tournant quotidiennement pour minimiser les dommages potentiels causés par des traitements répétés.

Les expériences ont duré 8 jours. Six injections IM quotidiennes de 15 μl ont été administrées avant les interventions chirurgicales pour permettre au CBD, un médicament lipophile avec un grand volume de distribution et une longue demi-vie d'élimination, d'atteindre des niveaux proches de l'état d'équilibre59. Au jour 7, les oiseaux ont reçu une injection préopératoire et des chirurgies de microlésions unilatérales ont été réalisées selon les méthodes détaillées ci-dessous. Notez que les microlésions unilatérales de HVC perturbent de manière significative, mais temporaire, les vocalisations d'une manière cohérente avec l'approche bilatérale utilisée précédemment, sauf que l'ampleur des perturbations a été réduite de manière prévisible (voir Fig S1 supplémentaire). Les effets comportementaux maximaux des microlésions HVC unilatérales ont été observés 24 h après la microlésion, qui est le point temporel utilisé pour les présentes expériences. Au jour 8, les oiseaux ont reçu une injection postopératoire de CBD le matin et euthanasiés l'après-midi pour l'extraction de l'ARN, ou la perfusion et l'isolement du tissu cérébral fixé au paraformaldéhyde. Toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur.

Des diamants mandarins mâles adultes (> 90 jours) ont été élevés dans notre volière d'élevage et maintenus à 78 °F sur un cycle lumière/obscurité de 12/12. Les mâles étaient exclusivement utilisés en raison de leur capacité à produire des chansons. Les oiseaux étaient logés dans des cages à pinsons standard (9″ × 11″ × 17″) avec de la nourriture et de l'eau à volonté. Les oiseaux ont été isolés visuellement mais pas auditivement, conformément aux expériences antérieures réalisées dans des chambres d'enregistrement12. Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Caroline de l'Est (voir les déclarations d'éthique ci-dessous) et cette étude a été menée et rapportée conformément aux directives ARRIVE60.

Pour réduire l'impact sur les animaux et améliorer la puissance statistique, nous avons modifié notre modèle original de microlésions bilatérales12 pour adopter une approche unilatérale qui permet aux sujets individuels de servir de leur propre contrôle interne. Nous avons ciblé les hémisphères gauches car les preuves indiquent une latéralisation similaire à celle caractéristique du langage humain61 illustrant davantage les parallèles entre la parole et le chant des oiseaux (également, les expériences d'optimisation initiales ont suggéré que la microlésion HVC de l'hémisphère gauche perturbait davantage la qualité vocale que celles ciblant les hémisphères droits, voir Fig S1 supplémentaire ). À l'exception de la modification bilatérale, les microlésions ont été réalisées comme décrit précédemment12. En bref, à l'aide d'un système d'anesthésie MIDMARK VMS (91 800 003 VMS), les oiseaux ont été initialement anesthésiés à l'aide d'isoflurane à 3 % (vaporisé avec un transporteur d'oxygène à un débit constant de 1,0 L/min). Les plumes du haut et de l'arrière de la tête ont été enlevées et les oiseaux ont été fixés dans un instrument stéréotaxique avec deux tiges métalliques insérées dans le conduit auditif et le bec placé sur la barre de bec. Fixé à la barre du bec était un tube de calibre 20 pour une livraison constante d'isoflurane pendant la procédure. La bifurcation au niveau du sinus sagittal médian a été utilisée comme zéro stéréotaxique. De petites craniotomies ont été placées sur le HVC gauche (après le retrait de la section du crâne, l'isoflurane a été abaissé à 2 %). Pour une destruction d'environ 8 % du VHC gauche, deux emplacements ont été ciblés : 2,4 et 2,8 mm du zéro stéréotaxique à une profondeur de 0,6 mm. Les microlésions ont été réalisées avec 100 µA pendant 35 s. Après lésion, l'isoflurane a été abaissé à 1 % avant suture. Les oiseaux ont récupéré dans un incubateur chaud et ont été renvoyés dans des chambres d'enregistrement. Notez que ces méthodes ont été adaptées de celles développées à l'origine par Thompson et Johnson, 200711. Notez également que notre étude antérieure12 démontrant l'efficacité du CBD pour améliorer la récupération vocale utilisait un modèle de lésion bilatérale, et non l'approche unilatérale adoptée ici. Il s'agit d'une limitation car nous ne démontrons pas l'efficacité du CBD pour améliorer la récupération vocale suite à notre méthode de lésion unilatérale révisée. Par conséquent, les mécanismes que nous identifions comme étant associés à l'efficacité du CBD ne sont pas liés de manière causale à la démonstration préalable d'une amélioration de la récupération vocale.

Des expériences d'expression génique ont été réalisées avec trois répliques biologiques de quatre à cinq diamants mandarins adultes par groupe de traitement. Pour chaque animal, un poinçon de biopsie stérile de 1 mm de diamètre sans ARNase a été utilisé pour exciser le tissu cérébral de trois régions d'intérêt, de chaque hémisphère (droit non lésé utilisé comme contrôle interne et gauche lésé) : HVC ; RA ; et Zone X. Des exemples d'images sont présentés dans la Fig. S2 supplémentaire. Des échantillons de cerveau ont été homogénéisés dans du réactif TRIzol (Invitrogen, 15 596 026) séparés à l'aide de chloroforme et précipités à l'aide d'isopropanol. L'ARN précipité a été lavé et remis en suspension dans de l'eau sans RNase. La qualité de l'ARN a été confirmée par électrophorèse sur gel. L'ARN total (250 ng) a été utilisé pour synthétiser l'ADNc en utilisant un kit de synthèse iScript (Bio-rad, 1 708 890). Les réactions terminées ont été diluées cinq fois, en triple en utilisant de l'eau sans ARNase. La PCR a été effectuée en utilisant le supermix vert SYBR (Bio-Rad, 1 725 271). L'amplification sélective a été confirmée à l'aide d'une analyse de courbe de fusion et les données ont été obtenues sous forme de valeurs de seuil de cycle (Ct) à l'aide du logiciel CFX Manager (Bio-Rad). L'expression génique a été normalisée au contrôle endogène (GAPDH) et le changement de pli a été déterminé à partir de l'hémisphère non lésé en utilisant la méthode ΔΔCt62. Les séquences d'amorces et les informations se trouvent dans le tableau supplémentaire S1.

Des diamants mandarins mâles adultes (n = 3–5) ont reçu des traitements médicamenteux pendant 6 jours, ont été microlésionnés au jour 7 et des perfusions transcardiaques ont été réalisées 24 h plus tard en utilisant 4 % de paraformaldéhyde pour la fixation et 30 % de saccharose pour la cryoprotection. Les cerveaux fixés ont été bloqués sur la ligne médiane, placés dans un milieu d'enrobage OCT, congelés à l'aide d'une suspension de 2-méthylbutane et de neige carbonique, puis sectionnés à 10 µm à l'aide d'un cryostat maintenu à -20 ° C. Des coupes parasagittales des hémisphères droit et gauche de chaque oiseau ont été montées sur des lames Superfrost Plus et stockées à - 20 ° C.

Les lames ont été bloquées avec du sérum de chèvre normal à 5 ​​% pendant 1 h à 37 °C. Les anticorps primaires ciblant diverses protéines ont été dilués dans du sérum de chèvre normal à 2 % et utilisés à des concentrations optimisées : anti-IL-6, 10 µg/ml (Biomatik, CAU30440) ; anti-IL-1B, 10 ug/ml (Mybiosource, MBS 2 090 494); anti-IL-10, 1:100 (BIOSS, AGO7251283); anti-PSD95, 1:50 (Santa Cruz, SC-32291); anti-vésiculaire GLUT2 (VGLUT2) 1:500 (Cell Signaling, 715,555); anti-TMEM119, 1:100 (Abcam, AB185337); NRF2 anti-phosphorylé (pNRF2), 1:200 (Abcam, AB76026); et contre-coloration nucléaire Hoechst, 1:10 000 (Thermo Fisher Scientific, H3570). La spécificité des anticorps primaires a été validée par Western blot, dont les images sont résumées dans la Fig S6 supplémentaire. Tous les anticorps primaires ont été incubés à 4°C pendant une nuit. Le lendemain, les lames ont été lavées avec du PBS puis incubées dans l'anticorps secondaire correspondant dilué dans du sérum de chèvre normal à 2% à 37 ° C pendant 1 h. Les anticorps secondaires étaient Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris (A32723) Alexa Fluor 647 chèvre anti-souris (A32728) Alexa Fluor 647 chèvre anti-lapin (A32733). Après une incubation d'une heure dans l'anticorps secondaire, les lames ont été lavées deux fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune, suivi d'une contre-coloration nucléaire de Hoechst. Après le quatrième et dernier lavage, des lamelles ont été placées sur des lames en utilisant un agent de montage diamant antifade (Invitrogen, P36961). Les réactions de contrôle ont été effectuées sans anticorps primaires pour démontrer l'absence de liaison non spécifique significative des anticorps secondaires (voir Fig S8).

Des analyses par Western blot ont été effectuées pour déterminer la spécificité des anticorps primaires utilisés avec le tissu de diamant mandarin (voir la Fig. 6 supplémentaire). Pour chaque transfert, des échantillons de protéines ont été préparés à partir de tissu cérébral homogénéisé (Fisher Scientific, PowerGen 1000 S1) dans un tampon de lyse et d'extraction RIPA (Thermo, 89 900) avec un inhibiteur de protéase (Thermo, A32953). Après homogénéisation, le mélange est agité au Rotomix pendant 2h à 4°C. Ensuite, le tissu a été centrifugé à 16 000 g pendant 20 min à 4 ° C, le culot a été jeté et le surnageant a été récupéré. Le tampon de lyse avec inhibiteur de protéase a été renouvelé pour chaque extraction. La concentration en protéines a été déterminée par le test Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23 227) en utilisant un tampon de lyse comme diluant pour le test et les dilutions ultérieures.

Pour la séparation électrophorétique, 4 µL d'échelle de protéines de précision plus bicolore (Bio-Rad, n° 1 610 374) ont été chargés dans la voie 1 d'un gel Mini-PROTEAN TGX à 10 % (Bio-Rad, n° 4 561 034) suivi de 20 µg de diamant mandarin. protéine cérébrale (dénaturée avec un tampon de charge 4 × laemmli à 95 ° C pendant 5 min) dans la voie 2. L'électrophorèse a été effectuée à une tension constante de 100 V pendant 75 min. La protéine a été transférée sur une membrane PVDF activée au méthanol en utilisant un système Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, 1 704 150) avec des paramètres déterminés par le poids moléculaire respectif. La membrane a ensuite été bloquée dans de la BSA à 5 % filtrée dans du TBST à 0,1 % pendant 3 à 4 h à 37 °C. Le tampon de blocage a été retiré, 7 ml d'anticorps primaire dilué dans du TBST à 0,05 % ont été ajoutés, puis ont été incubés sur une bascule à 4 °C pendant une nuit. Les anticorps ont été optimisés et les concentrations utilisées étaient les suivantes : anti-IL-6, 10 µg/ml (Biomatik, CAU30440) ; anti-IL-1B, 2 ug/ml (Mybiosource, MBS 2 090 494); Anti-IL-10, 1:1000 (BIOSS, bs-0698R-TR); anti-PSD95, 1:100 (Santa Cruz, SC-32291); anti-vésiculaire GLUT2 (VGLUT2) 1:1000 (Cell Signaling, 715 555); anti-TMEM119, 1:200 (Abcam, AB185337); NRF2 anti-phosphorylé (pNRF2), 1:1000 (Abcam, AB76026). Tous les tampons de dilution ont été préparés frais avant utilisation. Le jour suivant, l'anticorps primaire a été retiré et la membrane a été lavée 4 fois avec du TBST à 0,1 % pendant 10 minutes chacune. Après le 4e lavage, les membranes ont été incubées dans un anticorps secondaire approprié pendant 1 h sur une bascule à 37 °C. Les anticorps secondaires étaient IRdye 680RD Goat anti-lapin 1:10 000 (Licor, 925–68 071) et IRdye 800CW Goat anti-souris 1:10 000 (Licor, 925–32 210). Après incubation, l'anticorps secondaire a été retiré et la membrane a été lavée 4 fois avec du TBST à 0,1 % pendant 10 minutes chacune. Après les lavages, les images ont été capturées à l'aide d'un Odyssey M Imager (Licor, M3350).

Les anions superoxydes ont été détectés via 5 µM de dihydroéthidium (DHE, Invitrogen, D11347) selon un protocole précédemment décrit63. Le DHE imprègne librement les membranes cellulaires et réagit avec le superoxyde cytosolique (O2-) produisant de l'éthidium qui émet une fluorescence rouge lors de la liaison à l'ADN. Cette fluorescence peut ensuite être quantifiée64. En bref, le tissu cérébral a été rapidement disséqué et congelé instantanément dans un composé OCT à l'aide d'une suspension de 2-méthylbutane de neige carbonique. À l'aide d'un microtome de congélation (Epredia Microm HM525 NX Cryostat), des sections de 10 µm ont été coupées et montées sur des lames de microscope Fisher Superfrost Plus, puis 1 ml de DHE 5 µM dilué dans du PBS a été délicatement pipeté sur chaque lame et incubé à 37 ° C pendant 30 min à l'abri de la lumière, rincé deux fois avec du PBS et imagé.

Les images en fond noir pour l'identification régionale ont été obtenues à l'aide du logiciel Image-Pro Plus (version 6.3) et d'un microscope Olympus BX51 équipé d'un condenseur en fond noir à 12,5X (Fig. S2 supplémentaire). Les frontières des régions d'intérêt ont été tracées à partir d'images sur fond noir pour une superposition ultérieure sur des images confocales fluorescentes. Les régions d'intérêt comprenaient le HVC en dehors des infarctus, la PR et la zone X. Les sections contenant des parties des trois régions d'intérêt ont été identifiées pour assurer une représentation égale dans toutes les conditions de traitement. Les images fluorescentes ont été obtenues à l'aide d'un microscope à balayage laser Zeiss (LSM, 700 Axio Observer) avec des objectifs 40X (Plan-Apochromat/1,4 Oil DIC M27) ​​et 10X (EC Plan-Neofluar/0,30 M27). À l'aide du logiciel d'imagerie Zeiss ZEN Black, les images Z-stack ont ​​été compilées à l'aide de 5 tranches et analysées après superposition à une intensité maximale à l'aide de l'image J.

Le logiciel Image J a été utilisé pour analyser des images z-stack superposées converties en 8 bits avec un seuil appliqué de manière cohérente sur toutes les images de chaque région. Tous les fichiers d'image au format CZI ont été exportés à partir du logiciel ZEN Black sous forme de fichiers tiff en niveaux de gris et consolidés dans une projection z d'intensité maximale. Pour l'IL-6, l'IL-1B et l'IL-10, la valeur de gris moyenne de la coloration individuelle par rapport à la coloration nucléaire de Hoechst par région de chant a été quantifiée en pourcentage de l'hémisphère témoin. Notez que les mesures de fluorescence relative brutes et non transformées de l'expression des cytokines pour les hémisphères lésés et non lésés sont résumées dans la Fig. S5 supplémentaire. Pour le DHE, les valeurs de gris moyennes ont été déterminées et corrigées pour la fluorescence de fond en utilisant l'intensité moyenne en dehors de chaque région de chanson étudiée (Fig. 3B). Les groupes ont été comparés en utilisant un pourcentage de l'hémisphère de contrôle (Fig. 3C). La fluorescence cellulaire totale corrigée moyenne (CTCF) a été utilisée pour éliminer le bruit de fond à l'aide d'une zone circulaire cohérente (diamètre circulaire de 0,5 mm) : CTCF = densité intégrée - (intensité moyenne de la région du chant * intensité moyenne du fond). Pour l'analyse de la localisation nucléaire de pNRF2, le seuillage de couleur a été utilisé pour déterminer : (1) la zone de pNRF2 colocalisée avec la coloration nucléaire Hoechst et (2) la zone totale de la coloration nucléaire Hoechst. La zone nucléaire de pNRF2 a ensuite été exprimée en pourcentage de la zone nucléaire totale et comparée entre les groupes (Fig. 4B). Pour l'analyse du marqueur de microglie TMEM119 dans chaque région, la valeur de gris moyenne de la coloration TMEM119 a été normalisée par rapport aux noyaux colorés par Hoechst et calculée en pourcentage de changement par rapport à l'hémisphère témoin non lésé (Fig. 6B). Enfin, les densités de synapses glutamatergiques ont été déterminées en utilisant la colocalisation de VGLUT2 et PSD95 par zone de mesure (diamètre circulaire de 100 µm).

Les animaux ont été utilisés selon des protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Caroline de l'Est (ECU-IACUC). ECU-IACUC supervise un centre de recherche enregistré en vertu de la loi sur le bien-être des animaux (n ° 55-R-0010) et a approuvé une déclaration d'assurance du bien-être des animaux auprès du Bureau du bien-être des animaux de laboratoire D16-00,294. En outre, ECU a continué d'être pleinement accrédité par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des soins aux animaux de laboratoire (AAALAC). Il a été confirmé que ce travail impliquant des animaux, en particulier des diamants mandarins mâles adultes, respecte toutes les directives ARRIVE60, y compris, mais sans s'y limiter, la planification de l'expérimentation et la conduite de la recherche approuvée, ainsi que la rédaction et la révision du manuscrit pour s'assurer que toutes les informations sont disponibles et facilement accessibles.

Des analyses statistiques ont été effectuées avec GraphPad Prism 9.2.0 pour toutes les données histologiques, comportementales et d'expression génique. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une ANOVA à modèles mixtes suivie d'une analyse post hoc de Sidak pour identifier les différences entre les groupes. Une valeur p ≤ 0,05 était considérée comme statistiquement significative. Les résultats statistiques sont indiqués dans les légendes du texte et des figures.

Les ensembles de données utilisés au cours de l'étude actuelle sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous sommes reconnaissants au Dr Alessandro Didonna pour l'examen approfondi de notre manuscrit et pour avoir généreusement partagé son expertise liée à la neuroinflammation. Nous sommes également reconnaissants pour les conseils techniques et méthodologiques du Dr Srinivas Sriramula, du Dr Alexis Papariello, de Cindy Kukoly et de Michelle Cobb. Ce travail a été financé en partie par GW Pharmaceuticals et par le Département de pharmacologie et de toxicologie de la Brody School of Medicine de l'East Carolina University.

Département de pharmacologie et de toxicologie, Brody School of Medicine at East Carolina University, Greenville, NC, 27834, États-Unis

Mark Tripson et Ken Soderström

Département d'anatomie et de biologie cellulaire, Brody School of Medicine, East Carolina Diabetes and Obesity Institute, East Carolina University, Greenville, Caroline du Nord, 27834, États-Unis

Karen Litwa

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MT, KS et KL ont conceptualisé et conçu des expériences, analysé des données et aidé à réviser le manuscrit. MT a réalisé les expériences et rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et contribué de manière significative à ce rapport.

Correspondance à Ken Soderstrom.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Tripson, M., Litwa, K. & Soderstrom, K. Le cannabidiol inhibe les réponses neuro-inflammatoires et la perte synaptique associée au circuit suite à des dommages à une région de type corticale pré-motrice vocale d'oiseau chanteur. Sci Rep 13, 7907 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34924-z

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Reçu : 09 février 2023

Accepté : 10 mai 2023

Publié: 16 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34924-z

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